Mol Psychiatry︱李伟广/徐天乐/江帆团队合作揭示恐惧消退形成新记忆的动态印迹网络机制
撰文︱谷雪，李伟广
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
记忆是人脑通过识别、处理、储存复杂的感觉信息，并依据这些信息做出适当行为反应的生理基础。大脑通过处理记忆的神经信号将经验转化为概念，进而在事件之间建立联系，推演事物发展的趋势，使得记忆成为人类智力的核心。人类在遭遇创伤应激后产生强烈、持久的情感记忆或特定持续病理状态，称为病理性记忆，其易形成、难忘却，是导致抑郁症、焦虑症等情感和精神障碍的首要因素。以恐惧情绪体验为例，后者根植于大脑之中，形成牢固的恐惧记忆［1］。消退训练是形成用以对抗固有恐惧记忆这一新认知的过程。有人提出，消退训练涉及到针对固有恐惧记忆的解除学习（unlearning）机制［2］，但更多证据支持消退训练中新形成（new learning）的消退记忆可作为一种独立的、关于某件事情“不再发生”的抑制性记忆［3］。在生理上，消退记忆是根据情景变化灵活调整行为策略的根本保障，是“趋利”的前提基础；在病理上，消退记忆是从认知层面矫正病理性记忆的有效途径，是“避害”的实现形式。在临床上，以消退记忆为基础衍生的暴露疗法在相关精神障碍治疗中应用广泛［4］。遗憾的是，相比固有的恐惧记忆，新形成的消退记忆非常脆弱，特别容易遗忘［5］或失效，导致固有的恐惧记忆重现或自发恢复［6］。针对恐惧记忆消退后重现的神经生物学机制，徐天乐团队曾于2021年揭示了恐惧记忆消退-重现转换的场景依赖性以及感觉输入联合性的突触整合规律［7］，为认识情感障碍性脑疾病尤其是难治性（易复发）抑郁症和焦虑症等疾病的病理机制提供了新线索。
近年来，现代生物学家通过对记忆相关神经网络的活动进行动态记录和操控，提出了具有单细胞分辨率的记忆“印迹细胞”（engram cell）理论，发现大脑中存在由少量关键细胞组成的细胞群，分散于不同的脑区，其活动足以回溯记忆［8］。研究人员借助分子生物学发展出来的以活性细胞群靶向重组（targeted recombination in active populations, TRAP）为代表的神经活性原位捕捉标记技术，利用光遗传学技术选择性操控记忆形成过程中被激活的神经元，从观察性（observational）研究、功能缺失性（loss-of-function）研究、功能获得性（gain-of-function）研究和模拟性实验（mimicry experiments）等多方面，对大脑中的记忆印迹细胞进行了广泛的概念性论证（proof-of-concept）。记忆印迹细胞的发现和发展迅速推动了记忆神经生物学机制的研究，成为大脑信息编码与存储机制研究的全新切入点。2019年，研究人员在海马齿状回鉴定出场景条件恐惧模型中恐惧记忆印迹细胞和消退记忆印迹细胞，二者相互独立且发挥着各自的功能［9］。之后人们在杏仁核脑区也发现了消退记忆印迹细胞［10］。针对声音线索式恐惧模型中的消退记忆印迹细胞至今还没有被鉴定。不仅如此，以记忆印迹细胞的研究为起点，在记忆印迹神经环路和印迹连接等层次还未系统解析记忆印迹的物质内涵。事实上，在神经连接水平，记忆的编码并非依赖于不同脑区神经元之间的硬线连接（hard-wired）模式，更可能依赖于不同脑区印迹细胞之间的动态神经连接［11］。
2022年7月8日，上海交通大学基础医学院徐天乐教授团队和国家儿童医学中心（上海）、上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心江帆教授团队，与复旦大学脑科学转化研究院李伟广研究员等合作在Molecular Psychiatry杂志上发表了题为“Dynamic tripartite construct of interregional engram circuits underlies forgetting of extinction memory”的研究论文［12］。上海交通大学基础医学院谷雪博士和吴延娇博士为共同第一作者。该研究创新性地发现了以内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）为中心的消退记忆印迹神经网络，刻画了其中印迹神经连接在执行记忆功能方面表现出的定向性特征，同时也揭示了跨脑区印迹神经连接强度的动态变化规律，为理解消退记忆容易遗忘或失效的行为学特征提供了最直接的神经生物学证据。
为鉴定消退记忆的印迹细胞基础，研究人员基于TRAP技术［13,14］，利用TRAP2::H2B-GFP双转基因小鼠进行记忆印迹细胞标记。首先对小鼠进行条件性恐惧学习和消退训练，实验组小鼠在消退训练第三天前30 min腹腔注射:4-羟基他莫西芬（4-OHT）用以标记行为激活的细胞，对照组小鼠则维持在原饲养笼中（homecage）注射4-OHT。研究人员用H2B-GFP的表达来代表行为处理激活的神经元，发现消退记忆激活了大量的脑区，比如H2B-GFP在mPFC、基底外侧杏仁核（basolateral amygdala，BLA）和腹侧海马（ventral hippocampus，vHPC）等脑区均有高表达，和丘脑相关的核团如丘脑室旁核（paraventricular nucleus of the thalamus, ，PVT）、团状核（nucleus of reuniens，RE）以及之前认为和恐惧及消退无关联性的脑区，如外侧下丘脑（lateral hypothalamic area，LHA）区域也被显著激活。这些结果提示我们：在mPFC、BLA和vHPC等多脑区都存在消退记忆印迹细胞。
研究人员通过检测消退记忆印迹细胞在不同记忆提取时的再激活情况，进一步分析了记忆印迹细胞的特异性。如前所述，研究人员在对TRAP2::H2B-GFP进行消退记忆印迹细胞标记的基础上，再将小鼠分别进行消退记忆提取或恐惧重现（即为恐惧记忆提取）测试。荧光染色结果显示，消退提取组和恐惧重现组在mPFC、BLA和vHPC等脑区中H2B-GFP阳性神经元和c-fos阳性神经元在数量上并无差异，但消退提取组的共标率显著高于恐惧重现组。这些结果表明，消退记忆印迹神经元在消退记忆提取时被再次激活，在恐惧记忆提取时被显著抑制（图1）。
图1 消退印迹细胞的定位分布及鉴定
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
为研究消退记忆印迹细胞的行为学意义，研究人员利用光遗传学进行功能缺失和功能获得实验。采用如前所述的记忆印迹细胞标记策略，研究人员在消退记忆提取阶段分别利用Cre依赖表达的NPHR或ChR2进行光遗传学抑制或激活实验。结果发现，在消退记忆提取阶段，光抑制mPFC、BLA或vHPC的消退记忆印迹细胞可明显抑制消退记忆的提取，促进恐惧记忆表达；相反，在恐惧重现激活，光激活mPFC或BLA的消退记忆印迹细胞可明显抑制恐惧重现，促进消退记忆的提取（图2）。这些实验结果表明，利用TRAP标记的记忆印迹细胞对于消退记忆提取的必要性和充分性，同时暗示多脑区的记忆印迹细胞依赖于互作交流以确保消退记忆的提取。
图2 消退印迹细胞的双向操纵控制消退记忆的提取
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
为探究多脑区弥散分布的消退记忆印迹细胞之间是否存在功能上的联系，研究人员进一步检测了干预BLA或vHPC消退记忆印迹细胞是否会影响mPFC记忆印迹细胞。他们利用TRAP2::H2B-GFP进行记忆印迹细胞标记，发现在homecage利用光遗传学激活BLA或vHPC消退记忆印迹细胞，观察到mPFC中c-fos表达显著升高，而且其消退记忆印迹细胞（H2B-GFP阳性）与c-fos（红色）的共标显著高于对照组。相反，在消退记忆提取阶段，利用光遗传学抑制BLA或vHPC记忆印迹细胞，发现抑制mPFC中c-fos表达及其与H2B-GFP阳性细胞的共标比例。这些实验结果表明，BLA和vHPC向mPFC的功能性印迹连接调控了消退记忆的提取（图3）。
图3 干预BLA或vHPC的消退记忆印迹细胞可以调控mPFC消退记忆印迹细胞的活性
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
研究人员进一步利用狂犬病毒对mPFC消退记忆印迹细胞进行上游单突触神经环路追踪，发现BLA和vHPC细胞与mPFC消退记忆印迹细胞存在直接的单突触输入。为直接探究BLA和mPFC记忆印迹细胞之间的定向突触联系，他们通过在mPFC或BLA表达Cre依赖的破伤风毒素轻链（light chain of tetanus toxin，TetTox）从而失活其记忆印迹细胞，同时将ChR2表达在BLA或mPFC，以期检测失活mPFC或BLA记忆印迹细胞的前提下，激活另一个脑区BLA或mPFC记忆印迹细胞的行为学效应。结果发现，失活mPFC记忆印迹细胞后，光激活BLA组记忆印迹细胞无法逆转恐惧重现；在相反的方向上，失活BLA记忆印迹细胞后，继续光激活mPFC记忆印迹细胞则可以逆转恐惧重现，促进消退记忆表达。类似地，失活mPFC记忆印迹细胞后，光激活vHPC组记忆印迹细胞无法逆转恐惧重现；在相反的方向上，失活vHPC记忆印迹细胞后，继续光激活mPFC记忆印迹细胞则可以逆转恐惧重现，促进消退记忆表达（图4）。这些实验结果说明mPFC与BLA、vHPC记忆印迹细胞间具有定向性，其中mPFC作为消退记忆印迹网络的中枢，通过自下而上的传输模式整合来自BLA和vHPC的印迹特异性输入，进而调控消退记忆。
图4 消退记忆提取依赖于BLA→mPFC和vHPC→mPFC印迹环路
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
记忆印迹突触的稳定性是记忆强度维持的物质基础。然而，消退记忆并不稳定，随时间推移，消退记忆对于恐惧记忆的抑制作用慢慢减弱，表现为固有恐惧记忆的复发，称为自发恢复（spontaneous recovery），可能是消退记忆稳定性丢失造成的。为此，研究人员利用TRAP标记多脑区记忆印迹细胞结合光遗传学和电生理记录的策略，检测了BLAengram→mPFCengram和vHPCengram→mPFCengram在自发恢复时的突触连接强度。结果发现，伴随自发恢复时，这两条记忆印迹突触相比非印迹突触，在反映突触前递质释放能力的配对脉冲比值（paired-pulse ratio）这一指标上显著升高，反映记忆印迹突触强度减弱；有意思的是，经过再消退训练，这一指标得以恢复，表明再消退训练重建了BLAengram→mPFCengram和vHPCengram→mPFCengram记忆印迹突触的连接强度。通过比较反映突触后受体功能水平的AMPAR/NMDAR比值这一指标，观察到了类似的改变，即伴随自发恢复，消退记忆特异的记忆印迹突触后适应性改变丢失。有意思的是，在相反环路方向上，mPFCengram→BLAengram无上述突触适应性的改变（图5）。这些结果提示，恐惧自发恢复可能是由于特定方向性的消退记忆印迹突触连接强度减弱导致的，而再消退训练可再次恢复其连接强度，因此，维持记忆印迹突触连接强度的稳定性是记忆总是成功提取的关键。
图5 消退记忆印迹连接的动态重塑
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
基于定向记忆印迹突触连接稳定性对于记忆动态行为的编码机制，研究人员还进一步探讨了记忆印迹突触是否具备可逆性，即是否能够被重构形成以达到促进记忆表达目的。他们通过光控诱导长时程增强（long-term potentiation，LTP）从而特异性强化记忆印迹突触定向连接。利用前述类似的TRAP标记策略，他们在BLA和vHPC脑区的记忆印迹细胞内表达ChR2，在mPFC埋植光纤。研究发现，在行为学上，高频刺激特定的印迹输入可以抑制恐惧记忆的自发恢复，同自然线索诱导的消退记忆提取（即自发恢复前再消退）强度相当。进一步通过在体光纤记录检测了LTP诱导前后mPFC消退记忆印迹细胞的活性，发现LTP诱导后光激活上游印迹细胞可以显著增加下游印迹细胞的活性。这些结果表明，印迹连接间突触效能的动态修饰调控了消退记忆的提取，从而抑制恐惧记忆的自发恢复（图6）。
图6 光控LTP增强印迹连接促进消退记忆的提取
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
图7 工作总结图：动态印迹网络介导消退记忆从形成到遗忘的机制
（图源：Gu, et al., Mol Psychiatry, 2022）
该研究通过综合运用动物行为学、神经活性捕捉原位标记、光遗传学、神经环路示踪、电生理、在体光纤记录等多种技术手段，针对恐惧消退中形成的新记忆 — 消退记忆，在记忆印迹细胞群及其互相连接构成的印迹环路和印迹网络层面，揭示了消退记忆从形成到遗忘的基本演化规律，为理解抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍等重大情感障碍疾病治疗后复发提供了全新的思路。为进一步发展针对相关情感障碍疾病的抗复发治疗策略奠定理论基础。同时，该研究有望为阐明更多记忆类型在印迹细胞及印迹环路和网络层面的组织规则提供了研究模式借鉴，为解析情绪情感编码原理提供了全新思路（图7）。
消退印迹细胞在大脑中的广泛分布又提出了新的科学问题：这些细胞以何种方式连接，其内在的环路组织规则是怎样的？该研究表明自下而上的印迹连接（并非相反方向），即BLA到mPFC和vHPC到mPFC的印迹投射是介导消退记忆提取的关键，它们以定向、协同的方式对消退记忆表达进行组织编码。其中，定位在其他区域的印迹细胞是否表征着不同类型的记忆信息？BLA、vHPC与mPFC消退记忆印迹细胞之间存在长程直接联系。其中，BLA消退印迹细胞可能携带有情绪效价相关的信息，而vHPC消退印迹细胞可能携带场景相关信息。此外，狂犬病毒辅助逆向跨突触示踪的结果显示，还有多个与消退记忆调节密切相关的脑区，它们是否以模块化的方式编码不同的信息，然后汇聚在mPFC进行加工，这些具体细化的整合模式还不得而知。
在突触水平上，研究人员还进一步研究了BLA→mPFC和vHPC→mPFC神经投射的印迹突触连接强度。随着时间的推移，消退印迹细胞及其连接弱化为沉默态，消退记忆变得不稳定，额外的消退训练或光控诱导LTP可以通过增强印迹连接使其恢复。
总之，该项研究提供了消退记忆印迹网络的工作模型，揭示了基于消退记忆提取的特定方向性印迹连接，同时解析了伴随消退记忆不稳定性的印迹连接的动态规律，为理解消退记忆的编码和储存提供细胞类型特异性的理论依据，也为相关精神疾病的治疗提供借鉴意义。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41380-022-01684-7
通讯作者课题组简介（上下滑动阅读）
徐天乐教授团队长期致力于脑认知原理解析基础与临床转化研究。在微观层面，以阐述神经细胞信号转导机制及其生理功能为目标，研究新型离子通道——酸敏感离子通道（acid-sensing ion channel，ASIC）——在突触可塑性以及学习记忆中的作用和机制；探索在脑卒中、慢性痛及其相关情感障碍中，离子通道和神经信号异常调控规律和新型干预。在介观层面，从记忆的视角研究“情绪（如恐惧、快乐）-情感-共情”及其与记忆、注意和社交行为等相互作用的长程与局部环路机制，启发精准神经调控新技术。
李伟广研究员曾长期为徐天乐教授课题组研究骨干，参与课题组相关研究（包括本项研究）。2021年9月，他加入复旦大学脑科学转化研究院，组建记忆原理及应用研究课题组（https://itbr.fudan.edu.cn/info/1443/2552.htm）。他们近年来专注于消退记忆的神经生物学基础研究并逐步形成特色与优势，在促进对记忆原理认识的同时，也为情绪障碍相关脑疾病治疗和干预提供了理论指导。他们揭示了消退学习相关新型环路和分子机制：首次鉴定了酸敏感离子通道（ASIC）在消退学习相关各脑区中的作用，率先刻画了从vHPC到mPFC神经投射突触的适应性（Sci Adv, 2018）［15］；研究了ASIC调控突触传递和可塑性的信号通路，揭示了记忆范式特异的可塑性调控机制（Sci Signal, 2018）［16］；揭示了条件性味觉厌恶记忆消退学习的新机制，发现ASIC在岛叶皮层通过调节长时程突触抑制（long-term depression，LTD）可塑性促进消退学习的突触和分子机理（Nat Commun, 2016）［17］。他们还阐释了消退后记忆重现突触可塑性新规律：通过示踪皮层和海马向杏仁核的聚合性神经传入投射，构建了恐惧记忆消退-重现转换的场景依赖性以及感觉输入联合性的突触整合规律（Natl Sci Rev, 2021）［7］，后者以“恐惧记忆总是重复出现的关键神经机制”为题，获评为中国神经科学学会2021年度“中国神经科学重大进展”。本项研究是该团队在消退记忆原理解析方面迈出的重要一步。
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本文完